血管细胞与非编码RNA

 
      非编码RNA与包括心脑血管疾病在内的多种人类疾病密切相关。作为近年来新发现的重要调节因子，非编码RNA参与调控血管生成、维持血管的完整性、血管细胞的命运决定以及血管细胞对环境刺激因子的应答，对维持血管正常功能是不可或缺的。随着非编码RNA研究的逐步深人，越来越多的新型非编码RNA被人们所发现，这可能为治疗包含血管疾病在内的多种疾病提供了新的突破口，有助于更深入地洞察非编码RNA的潜在生物学功能，找到新型的诊断标志物和治疗靶点，提供更好的治疗途径。
一、非编码RNA的研究现状
      非编码RNA的研究是后基因组时代的挑战之一。在传统理论中，RNA被认为是DNA和蛋白质之间的信使分子。随着具有调控功能，特别是具有表观遗传调控功能的非编码小分子RNA的发现，将RNA的功能从中心法则中遗传信息的传递体拓展并上升至修饰、整合和调控基因的表达，使RNA的功能由遗传信息的简单传递者兼任为遗传信息的组织者，并在一定程度上被赋予“监护”使命，是遗传信息的“忠实伴侣”。研究表明，非编码RNA在染色质重构、表观遗传修饰、干细胞干性维持、胚胎发育、细胞分化、凋亡以及免疫应答等多种重要生命活动中发挥关键的调控作用。不仅如此，面对环境和遗传的波动变化，非编码RNA通过维稳机制监管着转录过程，减少转录数量的异常波动，增强生命过程的强韧性，抵抗由遗传和环境变异产生的剧烈表型变动。多种证据提示了生物体内存在着由非编码RNA介导的遗传信息表达调控网络。
      非编码RNA并不是冗余的转录序列，它在生物遗传和进化中可能扮演重要的角色。非编码序列转录产生包括microRNA(miRNA)、piRNA和长链非编码RNA(lncRNA)在内的大量非编码RNA，在核内与核外等多种层面上控制着基因的表达。非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA，转录后在RNA水平上行使生物学功能，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、piRNA、ceRNA和lncRNA等多种已知功能和未知功能的RNA。从长度上来划分可以分为两类:小于40 nt,包括miRNA、siRNA、 piRNA；大于40 nt,包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和IncRNA等。以miRNA为代表的具有关键调节作用的非编码RNA研究有助于阐明人类疾病的发病机制，为疾病的预防和诊断提供了新思路，特别是为开发微小RNA作为治疗疾病的药物具有重要的指导意义。
      涉及基因组修饰、转录和转录后调控的三种热点非编码RNA为miRNA、piRNA和IncRNA。
二、非编码RNA对血管细胞的调控作用与机制
      非编码RNA是基因组中不编码蛋白的一类RNA，现在很多研究显示非编码RNA在血管系统高度表达，在血管细胞形成、分化过程中发挥重要作用。其中的miRNA是一组生物进化过程中高度保守的非编码的小RNA，在转录后水平调控基因表达。其在血管内皮和平滑肌细胞的发育、功能方面都有重要调控作用，对维持血管正常功能是必须的。
（一）非编码RNA与血管细胞命运决定及分化
      血管发育是胚胎发育的重要过程，内皮祖细胞在血管生长的原位分化为成熟内皮细胞并形成血管。血管内皮细胞在血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor, VEGF )信号通路调控下，形成血管网，但新生成的血管网不成熟、易渗漏。在一些血管生长因子(如VEGF、Angiopoietin1、Ephrin B2等)的刺激下，新生的血管网继续重塑，形成成熟的血管。非编码RNA作为近年来新发现的重要调节因子，有研究证实内皮细胞特异性miRNA参与控制细胞对血管新生刺激因子的反应。Dicer是miRNA形成过程中的关键酶，Dicer 敲除的小鼠模型中，胚胎和卵黄囊中血管的形成和维持都受到严重破坏。血管内皮细胞体外培养实验也显示Dicer在血管新生过程的多个环节都起作用，包括血管内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管网的形成凹，显示miRNA与内皮细胞功能密切相关。血管发育是胚胎发育过程中的重要事件，大量的miRNA参与了血管形成及相关疾病发生的过程。miRNA 126是内皮细胞特异表达的miRNA,位于表皮生长因子17( epidermal growth factor 17, EGF17 )基因的一个内含子内，参与调节血管生成和维持血管完整性。miRNA-126通过血管内皮生长因子信号途径，参与调控主动脉弓血管的形成(101。部分缺乏miRNA-126的小鼠也可以存活，但其血管较脆弱且通透性增高。miRNA-143和miRNA-145由同-miRNA前体所编码，在血管平滑肌细胞中特异性表达。体外实验报道显示血管平滑肌细胞的分化依赖于miRNA-145。但是miRNA-143和miRNA- 145双敲除的小鼠也可以存活，这提示体内可能存在着其他更深层次的调节机制。还有研究显示，过表达miRNA-145 可以有效抑制Klf4的表达，从而促进ES细胞向血管平滑肌细胞分化，但如果miRNA-145的表达被抑制，则Klf4表达上调，ES细胞向血管平滑肌细胞分化的效率显著降低。上述文献结果显示非编码RNA与血管细胞的分化有密切关系，可能参与血管细胞命运决定与分化。
（二）非编码RNA调控血管新生
      成体血管新生主要是在血管生长因子的作用下，内皮细胞迁移构建的空腔管道在相关基因和信号通路的调控下装配成管腔，经过重构，随后血管平滑肌进入内皮网，使血管具有弹性与伸缩性以具备调控血流的功能，这一过程受到多种因素和步骤的复杂调控。血管内皮细胞是血管内层的细胞，一且血管内皮细胞接受到来自机体的信号，内皮细胞就聚集在一起形成索状结构，逐渐形成血管内壁。对成人而言，血管生成信号如VEGF在内皮细胞内被激活会刺激生成新血管。最近研究表明，非编码RNA可能在调控血管新生和再生过程中具有重要作用。Die基周蔽除的小鼠胚胎时期血管形成缺陷，主要的血管生成调节因子如VEGF、Fltl、KDR Tiel 等都异常表达间。内皮细胞是参与血管新生的主要细施成分。在人微血管内皮细胞中破低Dicer会显著减弱血管新生反应。通过对人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cll, HUVEC )的miRNA表达谱分析，发现有27个在HUVEC高表达的miRNA.并且通过生物信息学方法分析发现Fu、Flk1、 Ckit以及Te2等一些重要的血管生成因子的受体可能就是这些miRNA的靶基因。该研究组发现在内皮细胞分化及血管新生过程中起重要作用的C-kit基因是miRNA-21222的靶点。进一步研究发现miRNA-221及miRNA222可通过靶向调节干细胞因子受体C-kit或eNOS表达，进而抑制内皮细胞迁移、增殖及血管新生。采用siRNA的方法瞬时敲低HUVEC的Drosha和Dicer两种miRNA加工所必需的酶后发现，内皮细胞的管腔形成等血管新生表型在Dicer敲除的细胞中明显减少，而在Drosha敲除的HUVEC中无明显变化。
Let7可以通过调控血管新生抑制因子——血小板反应蛋白1 ( thrombospondinl )影响血管新生; miRNA- 130a可以通过调节GAX ( growth arrest specific homeobox gene )和HOXA5 ( homeobox A5 )的表达而促进血管新生。miRNA-126是血管内皮细胞特异性表达的miRNA，是血管新生信号通路中的正调节因子，对维持体内血管的完整性起关键作用。miRNA-126的靶基因为转录因子SPRED1 ( sprouty-related, EVH1 domain containing 1 ) 和PIK3R2 ( phosphoinositide -3-kinase，regulatory subunit2 )，通过抑制它们的表达从而促进血管生 长因子VEGF和成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor, FGF )生成而发挥作用，从而促进血管新生，维持血管的完整性。如果敲除 miRNA-126则导致血管发生缺陷，miRNA-126 基因敲除的小鼠则表现出血管发育延迟、血管内膜不完整、胚胎大面积出血以及部分胚胎致死，存活的小鼠血管新生明显减少。此外，miRNA- 27b、miRNA-210 及miRNA-126也具有促血管新生的作用。这些结果都提示miRNA在血管生成过程中可能的调节作用。此外，在肿瘤的血管新生研究中，发现一个能够被原癌基因Myc激活的miRNA基因簇 miRNA-17~ 92能够通过 抑制凝血酶敏感蛋白1 ( thrombospondinl, Tspl ) 和结缔组织生长因子( connective tsse growthfactorCTGF)的表达而促进肿瘤血管生成。研究与血管生成过程密切相关的miRNA将有助于发现新的调节血管新生的方法，并应用于缺血性疾病如心肌缺血、末梢血管疾病和糖尿病血管并发症等以及肿瘤的治疗。
（三）非编码RNA调控血管内皮细胞功能
      血管内皮细胞是血管内层的细胞，内皮细胞在血管新生、稳态和疾病发展中具有重要作用。有研究者在血管内皮细胞(从小鼠胚胎干细胞发育而成的血管内皮细胞)里寻找表达量高的miRNA。他们发现，miRNA-126在血管内皮细 胞中含量最丰富，且十分特异。miRNA-126 在内皮细胞的发育、增殖、迁移和形成血管的过程中具有调节作用。缺失miRNA-126的斑马鱼在早期的发育过程里不受影响，血管网络系统正常形成，但是血管形成后血管系统的功能不能正常执行，很快血管出现塌陷和内出血情况，这就证明miRNA-126具有维持血管正常形态和执行血管正常功能的作用。最近有研究发现在斑马鱼基因组内存在两个miRNA-126位点(miRNA-126a/b),可在体外和体内产生成熟有生物活性的miRNA。miRNA-126a/b参与调节胚胎血管完整性，且有协同效应。进步研究表明，miRNA-126a/ b通过调节内皮细胞中PAK1 ( serine/threonine p21 activated protein kinase 1 )的表达水平达到调节血管完整性的目的。在小鼠中miRNA-126的表达也具有内皮细胞特异性，在敲除miRNA-126的小鼠中有40%在胚胎期或围产期死于严重的系统性水肿、多发性出血和血管破裂，提示miRNA-126在胚胎发生时对维持血管完整性有重要意义。在HUVEC中发现了一些高表达的miRNA,其中miRNA-221和miRNA-222通过调控干细胞因子的配体基因C-kit的表达来影响内皮细胞分化和干细胞因子( stem cell factor SCF )依赖性血管新生。
      最近有实验显示miRNA与内皮细胞衰老相关。miRNA-34a 在衰老内皮细胞中表达水平升高，能够调节细胞增生和发育、其作用是通过 其靶基因SIRTI ( silent mating type infomation regulation 2 homolog1 )起作用。SIRT1是一种依赖NAD的组蛋白去乙酰化酶，它通过组蛋白赖氨酸残基的去乙酰化来调控下游基因表达，提高细胞代谢效率，抵御外界氧化应激反应。体内可通过降低SIRTI水平来提高P53的乙酰化程度。乙酰化的P53能够正反馈促进miRNA- 34a的表达，进一步抑制SIRTI 表达，最终促进内皮细胞衰老。在内皮祖细胞( endothelial progenitor cell, EPC )中过表达miRNA-34a也能够降低SIRTI的表达，加速细胞衰老。miRNA-217是SIRTI的内源性抑制剂，能通过SIRT1基因的3'UTR，抑制SIRTI的转录后翻译过程，降低SIRTI表达水平。增加miRNA-217的表达可诱导年轻内皮细胞出现衰老表型，反之，抑制miRNA-217的表达可延缓或减轻衰老细胞的表型改变。最近发现一种长链非编码RNA-TielAS能够调控血管内皮细胞功能。TielAS是一个进化上保守的非编码转录本，基因组定 位于Tiel基因的反义链。Tie1 是一种血管生成素在细胞表面的酪氨酸激酶受体。TielAS可能是通过与TielmRNA形成杂合链来调控TielmRNA水平，从而调控血管内皮细胞功能。在斑马鱼体内瞬时高表达Tie1AS能够影响血管形成，在培养的人血管内皮细胞中高表达TielAS同样能够影响血管形成。与这些表型相-致的现 象是，在人类血管疾病的样品中Tiel mRNA和TielAS的比例明显改变。这些结果说明维持一 定的Tiel mRNA和TielAS比例是维持血管内皮细胞功能的必需条件。以上结果说明非编码RNA在血管内皮细胞的功能方面有重要作用，对维持血管正常功能是必须的。
（四）非编码RNA调控血管平滑肌细胞功能
      血管平滑肌细胞是血管壁的重要组成部分，血管平滑肌的发育、表型转变和对损伤的应激，以及血管平滑肌的增殖和迁移都是血管发育生成和和相关血管疾病的重要事件。非编码RNA作为重要的细胞调节因子，与血管平滑肌细胞的增殖、迁移、调亡、分化的发生发展密切相关。平滑肌特异性的Dicer基因蔽除的小鼠，因为血管平滑肌细胞增殖和分化明显减少，导致血管壁变薄、收缩能力受损、出血以及血管平滑肌特异基因表达减少，最终引起胚胎致死四。结果显示Dicer介导产生的miRNA对血管平滑肌的发育、分化和收缩功能是至关重要的。miRNA-143和miRNA-145在血管平滑肌细胞中特异性表达。体外试验显示miRNA-143和miRNA-145可以抑制平滑肌细胞增殖，并促进细胞的分化，在平滑肌细胞的命运决定和可塑性方面发挥关键的作用。miRNA- 143和miRNA-145是通过调控转录因子EIK1和细胞周期抑制因子KFL4而发挥作用。miRNA-145是一种新血管平滑肌细胞表型的标记物和调控因子，通过腺病毒介导的miRNA-145高表达可以上调平滑肌细胞分化相关标记基因的表达(如平滑肌0-肌动蛋白和钙 调蛋白) m。在miRNA- 143和miRNA-145基因敲除的小鼠体内，具有收缩功能的成熟平滑肌细胞明显减少，而没有收缩功能的平滑肌前体细胞明显增多，显示miRNA-143和miRNA-145在血管平滑肌发育分化过程中具有重要作用。此外，过表达miRNA-145抑制KFL5的表达，从而抑制大鼠颈动脉球囊损伤造成的内膜增生。血管平滑肌根据环境条件的变化可表现出收缩型和合成型两种细胞表型。缺乏miRNA-143和miRNA-145的血管平滑肌细胞，在血管张力刺激反应下无法表现出收缩表型，并大部分保持在合成状态，同时显著促进主动脉和股动脉的血管平滑 肌细胞的增殖。这些结果表明，miRNA-143 和miRNA-145对血管平滑肌细胞的表型和动态平衡发挥了重要的调控作用。
      在球囊损伤血管模型和培养的血管平滑肌细 胞中，miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222 和miRNA-146a都发现有促进血管平滑肌增殖的作用。其中miRNA-21是第一个发现的能促进血管平滑肌增殖和存活的miRNA,通过沉默肿瘤抑制因子PTEN和Bcl2发挥其功能。miRNA-221和miRNA222通过抑制其靶点P27Kipl和P57Kip2而促进血管平滑肌细胞的增殖。miRNA-146a通过直接作用于其靶基因KLF4,具有促进体外血管平滑肌细胞的增殖和体内血管新生内膜增生的作用。反义miRNA-146a的寡核苷酸转染可以显著减少大鼠颈动脉球囊损伤模型的新生内膜增生，提示miRNA-146a对血管平滑肌细胞增殖有促进作用。另外也发现miRNA-26a具有抑制血管平滑肌细胞分化和凋亡以促进其增殖的作用。上述结果显示miRNA在血管平滑肌的增殖、分化、迁移以及表型改变等方面都有重要的调控作用。血管紧张素II作用的失调可导致动脉粥样硬化和高血压。最近的实验显示，在血管平滑肌细胞中评估对血管紧张素II的转录组反应，发现一个受血管紧张素II调控的长链非编码RNA,此长链非编码RNA能够作为miRNA-221和miRNA-222宿主转录本，这两个miRNA都与血管平滑肌细胞增殖有关。通过siRNA技术干扰这个长链非编码RNA能够降低血管平滑肌细胞增殖。可见长链非编码RNA对血管平滑肌的功能也有重要调控作用。