非编码RNA与血管相关疾病

      miRNA是一组生物进化过程中高度保守的非编码的小RNA，在转录后水平调节基因表达。研究显示miRNA在血管系统高度表达，在疾病血管中表达失调，在血管生物学及血管疾病中发挥重要作用。miRNA通过参与调控动脉粥样硬化、脂蛋白代谢、炎症、动脉重构、血管新生、平滑肌细胞再生、高血压、凋亡、血管内膜增生等血管病理进程，影响冠状动脉粥样硬化、糖尿病血管相关病症、肺动脉高压等血管疾病的发生发展。因此，miRNA有可能成为诊断和治疗血管疾病的分子标志物。
一、非编码RNA与动脉粥样硬化的发生和发展
      动脉粥样硬化( atherosclerosis, AS )是由多种病因造成的，以血管内皮损伤和脂质代谢紊乱为特征的慢性炎症疾病。动脉粥样硬化的发生发展是过程由多种复杂的级联式反应机制所调控，其中miRNA参与了基因的转录后调控。新近的些研究表明，miRNA通过其靶点对内皮细胞，血管平滑肌细胞、巨噬细胞和单核细胞等相关细胞功能和形态的调控，参与血管内皮细胞的损伤与修复、细胞炎性因子、生长因子等信号分子的表达与释放、脂代谢调节和血管平滑肌细胞的增殖与迁移等环节，直接或间接影响动脉粥样硬化的病变进程。最近的研究发现，冠状动脉粥样硬化患者的内皮祖细胞( endotheial progenitor cell, EPC)中miRNA-221和miRNA-222表达升高。EPC对维持血管完整性非常关键。Atorvastatin治疗冠心病患者后可增加EPC数目，降低miRNA-221和miRNA-22水平。冠心病患者中EPC数量显著降低，提示miRNA-221和miRNA-222表达水平与EPC数量成负相关。
(一) miRNA与动脉粥样硬化
1.miRNA影响血管内皮细胞的功能，参与血管平滑肌细胞的迁移和增殖         
      血管内皮细胞损伤是AS的重要始动因素，同时内皮细胞迁移增殖形成新的血管，参与损伤血管的修复。最近的研究显示miRNA参与并调控血管内皮细胞激活与损伤过程，在维持血管内皮的结构完整性和正常生理功能方面发挥多种作用。miRNA还可通过影响内皮细胞和平滑肌细胞的增殖与迁移及血管形成的能力等方式实现对血管壁细胞的调控作用。AS形成与发展的过程中，miRNA-21、miRNA-143、 miRNA-145、miRNA-155 、miRNA-221和miRNA-222等在血管平滑肌细胞 ( VSMC )中特异性地表达，调控VSMC表型的转化、增殖与迁移，影响AS的形成。miRNA-143和miRNA-145在平滑肌细胞中表达丰富，并有较高保守性，它们参与平滑肌细胞的分化和迁移。miRNA-143/145缺失小鼠动脉中层变薄，血压降低，显示平滑肌细胞稳态失衡。体外动物血管疾病模型，包括血管损伤、动脉粥样硬化及动脉瘤等可引起miRNA-43145表达下调，其表达下调可能加重血管损伤。结扎颈动脉诱导粥样硬化模型显示在miRNA-143/45缺失小鼠中，损伤血管的内膜新生显著减轻。miRNA-143/145缺失老年小鼠在无高胆固醇血症的情况下股动脉也会自发形成粥样斑块。在载脂蛋白E敲除小鼠中过表达miRNA-145可降低主动脉窦、升主动脉和头臂动脉的斑块大小，显著增加纤维帽面积，降低坏死核心面积并增加斑块胶原含量，从而增加斑块稳定性。对斑块细胞组分进行分析发现，SMC特异性过表达miRNA-145可显著减少巨噬细胞等炎细胞浸润，miRNA-143和miRNA-145的缺失可以促进血管平滑肌细胞的迁移、增殖和分化，从而促进冠状动脉粥样硬化。miRNA- 126能够促进内皮修复，发挥抗动脉粥样硬化的作用。组织损伤时，趋化因子CXCL12及其受体CXCR4能够对抗凋亡，募集前体细胞。动脉粥样硬化可刺激内皮细胞产生凋亡小体，分泌CXCL12， miRNA-126在凋亡小体中表达丰富，可介导CXCL12的产生。体内试验证实，过表达miRNA- 126可通过募集Scal⁺前体细胞，加强内皮细胞的修复，增加斑块稳定性，发挥了抗动脉粥样硬化的作用。
2.miRNA与免疫反应
      AS 与炎症和自身免疫密切相关，两者贯穿于动脉粥样硬化疾病的始终。
      miRNA在免疫炎症细胞因子信号转导的过程中发挥重要的调节作用。用LPS刺激人单 核细胞系巨噬细胞株( THP1 )可引起miRNA-132、miRNA-146和miRNA-155的表达水平升高，提示这些miRNA可能通过调节免疫细胞的功能和分化，参与调节血管壁的炎性反应。研究显示，miRNA-155通过对炎性反应相关蛋白编码基因的转录后调控，调节冠状动脉粥样 硬化的发生和发展。miRNA-155 缺失的巨噬细胞中细胞因子CCL表达减少，促进了单核细胞 在粥样班块的聚集；另外，miRNA-155 通过直接抑制BCL6的表达，减弱了NF-KB的信号转导。以往的研究提示，免疫应答与动脉粥样硬化斑块形成及稳定性有关，其中模式识别受体Toll样受体( TLR )在动脉粥样硬化斑块处表达上调，参与动脉粥样硬化的发病机制。近期的一项研究发现，在小鼠巨噬细胞中，多种TLR配体刺激可上调miRNA-146的表达，增加的miRNA-146具有很强的抗炎作用，可显著减弱IL6和TNFa等炎症因子的生成。该研究提示了免疫系统中的miRNA在动脉粥样硬化病变的进展及稳定性中 可能发挥一一定的作用。而在另外-项研究中， 过表达miRNA-125b可诱导血管平滑肌细胞炎症相关基因如IL6和单核细胞趋化蛋白1(MCP1)等炎症因子的编码基因表达增加。这此研究提示，miRNA通过调控各种参与动脉粥样硬化的炎症细胞的功能，诱导炎症因子的表达，从而影响动脉粥样硬化的发生和发展。
      miRNA在AS形成的炎症机制中扮演着重要角色，但miRNA和AS形成与发展关系的研究尚处在起步阶段，寻找在AS发生发展过程中发挥关键调控作用的miRNA,探索这此miRNA是如何相互作用组成调控AS病理进展的调控网 络等一系列问题还有待深人探讨。进一步探讨miRNA对AS的病理调控机制，将为研发抗AS新药开拓新的思路。
3.miRNA通过调节脂质代谢参与调节动脉粥样硬化
      大量临床和流行病学研究证实，血胆固醇水平升高是动脉粥样硬化疾病最重要的危险因素之一，而且胆固醇和胆固醇酯还是构成动脉粥样硬化斑块脂质核心的基本成分，miRNA对脂代谢的调节作用为防治动脉粥样硬化提供了新的靶点。肝中的miRNA-122通过激活腺苷酸活 化蛋白激酶( AMPK ),对肝的新陈代谢、胆固醇代谢、脂肪酸代谢和氧化均有调节作用，人工沉默miRNA-122后，模型小鼠血浆胆固醇的水平较对照组明显下降。巨噬细胞源性脂蛋白脂酶( LPL )促进动脉粥样斑块的形成，而在RAW264.7巨噬细胞中转染miRNA-467b模拟物或抑制剂后，发现miRNA 467b显著降低了脂质沉积和IL6、IILIB、TNFa以及MCP1的分泌，并进一步减轻了动脉粥样硬化。oxL.DL 可活化树突细胞，并触发动脉粥样硬化过程中的炎性反应，而oxLDLL对动脉粥样硬化的调控机制尚未完全明确。近期，越来越多的证据显示miRNA通过对oxLDL的调节参与冠状动脉粥样硬化的形成，并且miRNA除了对信号分子进行调节外，还通过对基因稳定性的调节及与其他表观因素的相互作用来维持oxLDL触发的炎性反应。另外，miRNA-122、miRNA-33、miRNA-758和miRNA-106b也可通过参与胆固醇代谢调节动脉粥样硬化的病理过程。
(二) IncRNA与动脉粥样硬化
      IncRNA是一类长度大于200nt且不表现出任何蛋白质编码潜能的RNA，在总非编码RNAs ncRNA )中占有相当大的比例。
      心肌梗死相关的转录本( myocardial infarction- associated transcript, MIAT )为IncRNA。对其体外功能分析显示，该基因第 5外显子单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism, SNP )的变异会增加MIAT的转录，是心肌梗死的敏感位点。IncRNA-ANRIL ( antisense noncoding RNA in the INK4 locus, ANRIL )即INK4基因座上的反义非编码RNA，位于染色体9p21区域，研究显示ANRIL基因携带者罹患心肌梗死的风险增加。ANRIL在不同组织中它的多个剪切体表达量不同。ANRIL转录本能在平滑肌细胞、内皮细胞、免疫细胞等多种细胞中检测到，并且它在外周血单核细胞及动脉粥样班块中高表达。近来一项研究发现染色体 9p21区域的一个SNP位点突变( rs10757278 )减少STATI与增强子的结合，结果可导致ANRIL表达址降低。而STATI为γ干扰索信号通路的重要分子，参与影响内皮细胞在动脉粥样硬化中的作用。故推测ANRIL或许可成为动脉粥样硬化病变的一种新的诊断标志物。这些研究成果为AS的诊断及防治提供了新的线索。
二、miRNA与肺动脉高压
      肺动脉高压( pulmonary areral hyrernsiono PAH )是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压大于25mmHg，或运动状态下大于30mmHg的一组临床病理生理综合征。其主要特征是肺血管阻力增高以及肺动脉平滑肌细胞的增殖活性增强。研究认为肺微小动脉内皮损伤是PAH的起始环节，血管内皮受损导致功能失调，产生异常的血管活性物质及细胞因子，这些异常因子直接作用于血管平滑肌，早期导致肺血管收缩，后期使肺血管壁发生病理改变，最后成为PAH。由于miRNA在血管中的多种效应，提示人们miRNA可能参与调控肺动脉高压的病理进展。
      有研究显示缺氧及炎症等与肺动脉高压相关的因素可引起血管细胞中的miRNA表达水平发生显著改变，提示这些miRNA很可能是调节血管稳态的关键枢纽。Caruso 等首先发现慢性缺氧及野百合碱( monocrotaline, MCT )诱导的大鼠肺动脉高压模型可引起miRNA-22、miRNA-30 和let-7f表达下调，miRNA-322 和miRNA-451表达上调。与正常肺动脉人群相比，肺动脉高压患者的肺动脉中miRNA-138、miRNA-367、miRNA- 27b、miRNA 302b、miRNA-145和miRNA-450a表达上调，而miRNA-204表达下调，提示特定miRNA可能在肺动脉高压的发生发展中起重要调控作用。PAH的肺组织主要形态学改变是肺血管的重塑过程，血管平滑肌细胞在其中发挥关键作用，miRNA可通过作用于靶基因，介导肺动脉高压引起的血管重塑过程。 
      有研究者筛查了人类PAH中377种miRNA的表达情况，发现miRNA-204表达水平显著下调，且其表达水平与疾病的严重程度相关。miRNA-204的表达下调可导致其靶标SHP2表达上调，诱导肺动脉血管平滑肌细胞增殖及抵抗凋亡，加重疾病进程。而异源过表达miRNA-204可减轻疾病严重程度。另外，miRNA-204的表达水平受转录因子STAT3的负性调节。该研究提示恢复miRNA-204的表达水平很可能成为治疗肺动脉高压的靶点。还有研究显示低氧处理诱导的肺动脉高压可引起miRNA-206表达下调，并证明miRNA-206通过调控HIF1a/Fhll促进肺动脉血管平滑肌细胞增殖，对抗细胞凋亡，加重肺动脉高压病理进程。除miRNA-204和miRNA-206参与调控，另有报道显示miRNA-145、miRNA-21和miRNA-1792家族与BMPR2通路破坏相关。最近的一-项研究发现离体及在体肺动脉高压模型可引起miRNA-424和miRNA- 503表达下调，miRNA 424和miRNA-503可对抗肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞增殖。在MCT及低氧诱导的大鼠肺动脉高压模型中，异源过表达miRNA-424和miRNA-503能够显著改善肺动 脉高压病理变化[291。 Guo等的研究显示低氧诱导的肺动脉高压下调miRNA-328的表达，过表达miRNA-328通过作用于靶基因胰岛素生长因子1 受体( insulin-growth factor 1 receptor )和L-型钙离子通道a1C,抑制肺动脉血管收缩效应，促进肺动脉平滑肌细胞凋亡，调控缺氧诱导的肺动脉高压病理进程。
三、miRNA与糖尿病并发症
      糖尿病是一种以胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足、血糖升高为主要特征的慢性代谢性疾病，糖尿病对机体的危害源于糖尿病并发症，尤其是糖尿病血管并发症，其发生率比非糖尿病病人高17倍，常见于心、脑、肾及视网膜，是患者致残的主要原因，严重影响患者的生存质量。2型糖尿病是遗传因素与环境因素共同作用所致。高糖、高脂等环境因素可导致体内miRNA表达异常，这在2型糖尿病患者胰岛细胞功能衰竭、胰岛素抵抗及糖尿病并发症的发生发展中起重要作用。通过对2型糖尿病中miRNA的研究，可进一步阐明2型糖尿病的发病机制，并为2型糖尿病及其并发症的预防和治疗提供新的方向。
      糖尿病慢性并发症是2型糖尿病患者死亡的主要原因，其进展缓慢，起病隐匿，一旦形成，病变很难逆转，因此，糖尿病慢性并发症的早期诊断和治疗较为困难。一些研究表明miRNA在糖尿病慢性并发症如糖尿病心血管病变、糖尿病肾病等的发生发展过程中起重要作用。持续高血糖状态能导致血管内皮细胞功能障碍。最近一项研究发现，高水平葡萄糖刺激的血管内皮细胞中，miRNA-221 高表达，而c-kit蛋白表达降低。c-kit 蛋白是一种干细胞因子受体，在内皮细胞的迁移过程中起重要作用。运用反义寡核 苷酸链抑制miRNA-221,可恢复c-kit 蛋白的表达水平并使血管内皮细胞的迁移功能有所恢复，提示miRNA-221-c-kit蛋白途径在糖尿病血管损 伤机制中起作用。另一项研究中 Wang等对大鼠的心肌微血管上皮细胞的miRNA表达谱进行了基因芯片分析，结果发现let-7e、miRNA-129、miRNA-291-5p、miRNA-320等11种miRNA高表达。其中miRNA-320负调控胰岛素样生长因子1 ( insulinlike growth factor, IGF1 )及其受体的上调是诱发糖尿病血管病变的重要因素之一。 动脉中膜钙化是糖尿病大血管病变的特征性改变之一，可作为糖尿病患者心血管事件、心血管疾病导致的死亡、脑梗死和截肢的独立预测因子。早期研究表明动脉中膜钙化仅是血管壁上钙磷的被动沉积，最近的研究则证实动脉中膜钙化是一种主动的、类似骨形成的调节与进展过程。糖尿病患者容易发生动脉粥样硬化病变，而血管内皮细胞凋亡增加导致内皮细胞屏障破坏是引起动脉粥样硬化病变发生发展的重要环节。研究表明，miRNA-21 在心肌细胞及血管平滑肌细胞中表达变化参与了细胞的调亡、增殖及氧化应激反应等多种病理过程的调控。也有文献报道，在血管内皮细胞中存在miRNA-21的丰富表达，但其在血管内皮细胞中的作用目前罕见相关研究报道。脂质沉积于血管内皮下是动脉粥样硬化的始动环节，伴随单核巨噬细胞浸润吞噬、泡沫细胞的产生以及炎症介质分泌增多，最终可以导致粥样斑块形成、血管狭窄引发冠心病。
四、非编码RNA在血管疾病防治中的机遇和挑战
（一）非编码RNA有可能成为诊断血管疾病的分子标志
       临床应用较广的传统血管疾病诊断方法有测量血压、血脂、超声、造影等，这些方法都有各自的优势和局限性，所以探索新的诊断方法是科学家们一直努力的方向。随着非编码RNA在血管疾病中的研究越来越深人，非编码RNA调控血管发生发展、损伤的机制也逐渐被人们所认识，科学家们意识到非编码RNA在血管疾病中扮演着极其重要的角色，其在致病机理的调控通路中占据着不可或缺的地位。研究一种疾病的致病机理最终目的还是要找到更好的途径进行治疗。同样的，既然非编码RNA在血管疾病中的作用如此关键，那么不难想象，着眼于非编码RNA很可能是治疗血管疾病的新的突破口。
      miRNA是一种单链非编码小RNA分子，长约18~25nt,在进化上相对保守，目前发现miRNA的作用原理主要为:通过5’端2-8nt碱基与靶基因mRNA的3'UTR区域或CDS区域互补配对，进而进行转录后调控。miRNA的调控作用涉及生命活动的方方面面，如增殖、分化、凋亡等。大量的研究结果表明miRNA的调控涉及多种疾病机制，血管疾病就是其中的一个重要方面。已有研究结果显示，miRNA在高血压、动脉粥样硬化、血管瘤、血管再狭窄等疾病的致病机理以及诊断预防中发挥着至关重要的作用。
（二）非编码RNA在血管疾病治疗中的前景和展望
      目前，治疗血管疾病的药物都是化学类物质，例如他汀类药物在动脉粥样硬化中应用较多，其治疗效果是不错的，但是随之出现的不 良反应也存在一定危险性。 例如，服用他汀类药物可能造成暂时性肝功能损伤且发生比率较高，对于有肝疾病的患者不适宜使用。此外，他汀类药物还可能引起肌肉损伤，如横纹肌溶解症。所以，科学家们还在不断研究探索更直接、更高效、更安全的治疗方法。
      基于非编码RNA在血管疾病中所发挥的关键调控作用，科学家们着眼于将其作为疾病诊断的分子标志物加以研究。不仅如此，非编码RNA同时也是血管疾病治疗的很好的潜在靶点。miRNA在血管疾病中的调控作用基本分为两类，即促进疾病发生和抑制疾病发生，于是，科学家们的着眼点便是选择致病通路中一个关键位置上的miRNA,以其作为靶点，体外合成它的抑制剂或模拟物，再运输进体内发挥作用，以此达到治疗的效果。miRNA模拟物即体外合成一段与目标miRNA序列完全一致的RNA序列，导人体内，模拟目标miRNA分子的抗血管疾病功能，以此达到治疗效果。miRNA抑制剂技术即选择一个具有促进血管疾病发生发展的miRNA分子，体外合成一段与其序列反向互补的RNA分子，导人体内，根据序列反向互补配对，将目标RNA的结合区域封闭，阻止其发挥作用，这样能够一定程度上抑制血管疾病的发生发展。
      miRNA在多种血管疾病中都有调控作用，如动脉粥样硬化、高血压、动脉瘤、血管再狭窄等，选择miRNA作为血管疾病的治疗靶点是 一个 全新的尝试，也可能是必然的趋势。首次选择一种生物分子药物进行靶向治疗的方法还不成熟，但是其自身独有的优势还是很明显的。首先，选择致病通路中的某个关键分子，直接对其进行控制，从分子水平解决最根本的问题，效果最直接最快速。其次，miRNA模拟物和抑制剂的成本较低，能够实现广泛应用。选择miRNA作为治疗靶点有其特有的优势，这为最终有效预防和治疗血管疾病带来了希望。