干细胞与血管修复

   
      干细胞拥有分化成各种不同细胞类型的巨大潜能，可以再生的组织和器官，因此干细胞具有十分制的研究前景。总体来说，干细胞可以分为胚胎干细胞和成人干细胞两大类。胚胎细胞主要从胚泡中获得，可以分化为各种组织类型；而成人干细胞主要来源于血液、骨髓、血管壁和其他组织，具有多种分化能力。
一、干细胞介绍
      干细胞( stem cell )是一类具有无限自我更新能力，可通过有丝分裂分化成多种不同的细胞和组织器官类型的细胞。在哺乳动物中，有两大类型的干细胞:①从囊胚期的内细胞团获得的胚胎干细胞;②从各种组织中分离出来的成体干细胞。在胚胎发育过程中，干细胞可以分化成各种特殊的细胞(又称多功能干细胞);在成年生物体中，干细胞和祖细胞作为补充和修复组织的系统，维持着再生器官的正常功能，如皮肤、血液、肠组织等。根据干细胞所处的发育阶段不 同，将其分为胚胎干细胞( embryonic stem cell,ESC)和成体干细(somaticstemcell,SSC)。根据干细胞的发育潜能不同，将其分为三类:全能干细胞(totipotentstemcell,TSC)、多能干细胞( pluripotent stem cell, PSC )和单能干细胞 ( unipotent stem cell, USC )。
二、干细胞的应用
      由胚胎干细胞的衍生物合成的人工血管，在临床前期研究中主要应用在小鼠心肌梗死、下肢缺血、静脉移植和动脉粥样硬化模型中。未来，更多的转化医学研究将应用于大型动物(如免疫抑制的猪)的体内，并逐步向1期临床试验发展。在生物工程学领域中，多能干细胞还将应用于组织置换。此外，在毒理学研究中，人类胚胎干细胞或人工诱导的胚胎干细胞分化的血管细胞或组织，可应用到专为单一病人设计的药物筛选中。血管再生在临床治疗上具有相当大的需求，它可以治疗多种缺血性疾病，为血管移植提供良好的基材，例如动脉瘤或外伤后的搭桥手术以及血管重建。
三、干细胞分类
       干细胞的种类可分为：（1）血管壁干细胞/祖细胞；（2）内皮祖细胞；（3）平滑肌祖细胞；（4）间充质干细胞；（5）诱导及部分诱导的多功能干细胞；（6）胚胎干细胞。
四、干细胞动员分化机制
（一）动员
（1）血管干细胞动员
       血管外膜如同一个储存未分化的干/祖细胞的蓄水池。这些细胞被动员后可从血管壁的壁龛释放出来。不断有实验数据表明，在损伤的动脉和动脉粥样硬化的血管中，当外膜发生炎症时，可产生一系列的细胞因子或酶可能直接或间接地刺激血管外膜的祖细胞动员。血管损伤、动脉粥样硬化病变或微血管(血管滋养管)均会明显增加血管外膜炎症反应的可能性。
在正常的血管壁，微血管局限于外膜中，而在动脉粥样硬化病变的血管中，除了血管滋养管提供营养以外，我们推测，丰富的微血管可作为运输已动员的造血干|祖细胞进人内膜的通道，随后这些干/祖细胞在内膜增殖，分化成平滑肌细胞。有实验发现，在血管内膜存在有来源于移植血管外膜的祖细胞，这表明移植血管外膜的祖细胞被动员后，可迁移过整个血管壁，最终分化为平滑肌细胞。
（2）骨髓干细胞动员
      壁龛是干细胞在骨髓中贮存的特殊位置，在这个微环境中，细胞能够保持未分化和分化后的静止状态。壁龛中的支持细胞在血管损伤和生理应激时，调节干细胞自我更新及分化的功能，并快速动员及招募干细胞到达血管损伤部位。其中VEGF作为一种内皮细胞特异性的生长因子，相当于血管新生的开关。在组织损伤后，其在循环中水平快速升高，可有效地动员内皮祖细胞到达损伤部位，诱导血管新生。
      进一步研究表明，激活的MMP9可催化膜连接蛋白形式的Kit配体转化为可溶性的形式，进而动员VEGFR2⁺内皮祖细胞，使他们从成骨细胞区域转移到富含血管的壁龛中，利于干细胞的分化和动员。MMP9的激活是以依赖NO的方式完成的，趋化因子可增加NO的生物活性，从而启动激活MMP9的过程。趋化因子SDF1和其受体CXCR4在招募干细胞到缺血区域起到重要作用。此外，抑制CXCR4可招募血管外周壁龛里的干细胞，反之，刺激CXCR4可动员静止休眠的细胞，这一过程需要激活蛋白酶或者干细胞激活趋化因子来实现。
      此外，雌激素可在颈动脉损伤后，通过提高动员和干细胞的增殖能力诱导其快速产生内皮单层细胞。红细胞生成素、他汀类治疗、运动都可以增加内皮祖细胞的动员，促进血管新生，并通过e-NOS依赖方式抑制内膜增生。
（二）分化
      干细胞受到外界多种细胞因子及血流机械力的刺激后，经过细胞内多条信号通路调控，使得内皮细胞或平滑肌细胞基因表达升高，最终分化为内皮细胞或平滑肌细胞。
（1）干细胞向内皮细胞分化
      大量体内外实验均表明，成人和胚胎干细胞通过不同的信号通路可以分化为内皮细胞，VBGF及其受体在其中起到重要作用。VEGFR2是血管母细胞早期的标记分子，在小鼠发育期，Brachyury阳性细胞可以迁移进人胚胎外的卵黄囊形成血管丛。VEGFA或内皮细胞生长因子受体(VEGFR1和VEGFR2)缺乏均会导致胚胎期血管发育的失败。在VEGF165的诱导下，多功能干细胞可激活MAPK/ERK信号通路，向内皮细胞分化。VEGFR2的磷酸化及其与磷脂酶 ( phospholipase, PLC )Cγ1和PI3K的相互作用，不但是人胚胎干细胞来源的FIk1 祖细胞生存和增殖的基础,也是它们向内皮细胞家系分化的保证。由此可见，内皮细胞生长因子在内皮分化中的作用中不只是简单地开/关机制，而是具有良好的调节方式。Flt1敲除的小鼠在妊娠中期因血管组织破坏而死亡，在酪氨酸激酶缺乏的小鼠体内，尽管VEGF可以和VEGFR1结合，却不能产生下游信号，但这种小鼠依然能正常发育。神经纤毛 蛋白1( neuropilin 1, NRP1 )在内皮细胞表面表达，与VEGFR2一起形成特异性的VEGFR165。 实验已证实，蛋白激酶A( protein kinase A, PKA )激活导致了VEGFR2和NRP1的过度表达，从而增加VEGFR2+的祖细胞对于VEGFR165的敏感性，增加分化能力。此外，剪切应力可上调PKA，这个过程是通过上调VEGFR可刺激VEGFR2+的内皮细胞分化实现的。
（2）干细胞向平滑肌细胞分化
      大量证据表明，平滑肌祖细胞可由成人和胚胎干细胞通过类似的信号通路，分化成为成熟的平滑肌细胞。在祖细胞的表面，PDGF受体、TGFB受体和整合素均可感知不同的信号。整合素由一系列异二聚体跨膜蛋白与不同的胞外基质蛋白结合形成，在细胞和基质蛋白之间双向传递信息。通过激活整合素受体的β亚基(酪氨酸磷酸化)，可传导信号影响细胞的生理功能，其中包括平滑肌细胞的分化。大量研究证实，平滑肌细胞分化主要依赖整合素01、β和a,与胶原IV的相互作用。
五、血管修复
（一）干细胞参与的内皮再生
      在内皮细胞死亡后，发生在内膜的内皮再生过程包括了两类细胞:存在于血管壁或是血循环中成熟的内皮细胞和内皮祖细胞。成熟的内皮细胞已被证实，无论内皮细胞的损失程度是轻微(单个或几个细胞损失)还是严重(血管成形术后)都能够依靠增殖和迁移的方式修复已损伤的细胞。大量证据表明，内皮祖细胞修复内皮细胞主要通过直接移植和间接释放血管生成因子两种方式。然而，内皮祖细胞的修复程度却根据不同的情况相差甚远。例如，在高脂血症诱导的内皮 损伤模型中，在易于形成斑块的区域，3% ~ 5%是Sca1+和c-kit细胞，而只有1%~2%是骨髓来源的内皮祖细胞。
（二）干细胞分化为平滑肌——内膜增生，血管再狭窄
      内膜中平滑肌细胞的聚集是动脉粥样硬化发展的重要事件。斑块中平滑肌细胞主要来源于血管中膜的成熟平滑肌细胞和血管壁及血循环中的平滑肌祖细胞。尽管祖细胞来源的平滑肌细胞在动脉粥样硬化中扮演的角色依旧是争论的热点，但是人们广泛接受在血管损伤的不同阶段，祖细胞能够促进斑块中平滑肌细胞的聚集。在静脉移植诱导的粥样硬化的早期，无论是小鼠模型还是人类移植静脉的内膜处，内皮细胞凋亡坏死明显增加，接着，祖细胞再生，单个核细胞浸润， 平滑肌细胞聚集，粥样硬化斑块形成。最近的数据表明，新生内膜的平滑肌细胞来源于血管壁的祖细胞。值得注意的是，血管壁常驻的祖细胞同样可以产生平滑肌细胞，动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞可来源于动脉壁的干/祖细胞。后续研究也的确证实在动脉壁存在可分化为平滑肌细胞的干细胞。
六、临床应用
（一）新药设计
      干细胞不但为研究疾病病理机制提供了新的方法，在药物筛选和测试药物的有效性与安全性上也起到了重要作用。为了寻找新的靶点，体外药物研发需要整合以下条件:①细胞模型与相关疾病患者的基因背景。充足的证据表明，人类与啮齿类或其他动物的生理、细胞生理、基因等方面都有着明显差异。在使用基于非人类模型系统研发的新药物时，可能存在潜在的问题。当所使用的细胞种类与特殊疾病不直接相关时，与该药物靶点相关的分子机制可能被掩盖，当药物作用于疾病相关的细胞种类时，其作用就会受到影响。②重新创造靶细胞的微环境。细胞的表型在很多重要方面依赖于其所处的微环境，例如细胞外基质的生物化学作用、基质的机械性质、复杂的生物力学、生长因子梯度等。③评估细胞功能。表型筛选是一种发现首创药物治疗的有效方法，应用具有功能表型药物所得到的实验结果比应用生化表型药物具有更大的相关性。通常而言，为了研究一种疾病，需要获取患有此种疾病病人的活检组织样品，然后针对每个病人，诱导产生胚胎干细胞，重新分化出大量与该疾病相关的细胞种类。细胞重组技术产生的诱导多能干细胞为有限的心血管细胞来源提供了潜在的解决办法。未来，可以在病人来源的心脏细胞上首先进行药物测试，以提前预知他们将如何影响病人。尤其重要的是，可以通过测试中需要病人的细胞的量来对该药物对病人的心脏毒性做出准确的评估，并对病人的药物敏感性进行生物标记。
（二）细胞治疗
      鉴于内皮祖细胞能够修复严重的内皮损伤，人们希望通过内皮祖细胞治疗改善血管功能。例如，经全身输血输人血管祖细胞后，内皮细胞功能得到明显改善，通过静脉输注内皮祖细胞到具体的血管损伤部位，可明显提高内皮再生化并减少内膜增生。毋庸置疑，基于内皮祖细胞的治疗技术可提高内皮细胞的功能和数量，这技术和策略引起了介人性心脏学领城的极大兴趣。与此观察结果相反的是，在猪模型上，内皮祖细胞介导的内皮再生化明显增加了内膜增生，预包被CD34抗体的支架被用来获取血循环中的内皮祖 细胞( CD34⁺细胞) 。在一期临床试验中，16例初始患冠心病的病人通过植人摄取内皮祖细胞的支架成功得到治疗。然而，内皮祖细胞也会造成斑块的发展和不稳定性，需要在血管治疗时谨慎考虑。斑块的破裂和出血与血管外膜的微血管的数量紧密相关，早期内皮祖细胞可分泌血管新生细胞因子，例如胸苷磷酸化酶，在体内促进内皮迁移和血管新生，通过参与疾病相关的血管新生，促进动脉粥样硬化发生发展。因此，在生理条件下，循环中的内皮祖细胞可修复和更新动脉，在病理状态下，早期内皮祖细胞可防止斑块的形成，但在晚期的病变中会降低斑块的稳定性，促进斑块进展。由此可见,在严重动脉粥样硬化病人中内皮祖细胞的治疗需要更加谨慎。
（三）人工血管
      当人们发现在动脉硬化血管中，干细胞是内皮细胞和平滑肌细胞的主要来源时，运用干细胞构建一个完整的组织工程血管的想法便成为现实。以前认为，内膜新生时，平滑肌细胞主要来源于中膜的细胞迁移进人新生内膜。然而目前已发现斑块中的细胞具有多种来源，包括循环血液中和邻近血管外膜的干细胞。这表明，由于在修复动脉时缺乏适当的负反馈机制，导致新生内膜过度增生，因此，干细胞来源的血管细胞可以在体内构建天然的血管或者重塑移植的静脉。血管旁路移植术是一种常用的替代缺血性心脏病及外周血管疾病中的阻塞血管的方法。然而，许多病人没有可以移植的健康血管。虽然直径较小的人造血管适合作为冠状动脉旁路移植术和下肢闭塞性动脉硬化症的移植导管，但是由于血栓的形成与阻塞导致这种人造血管的失败率较高。人工血管工程是一个相对较新的学科，它提供了来自白体细胞或其他的干细胞来源的替代结构。目前已有几个实验室通过使用干细胞，在体内或体外利用模具或可生物降解的支架来制造组织工程血竹。但是，每种人工血管都存在明显的问题。另有研究组报道了一种新的生产完全生物组织和器官的策略，它可以显示出相当高的机械强度，而不需要任何外源性的塑料支架。这种技术产生的完全生物的血管可满足移植的基本要求。这些人I血管已成功地应用于血液透析的动静脉瘘。在这一领域最新、最重要的发展是在体内和体外使用多功能干细胞作为细胞源生产人造血管。我们相信这一种技术将显著改善患有严重血管疾病患者的预后。
      近年来，血管干细胞的研究取得了明显的成果。到目前为止，从血管壁的内膜到中膜再到外膜，研究均已发现血管壁干细胞。当受到外界炎症刺激或血管损伤时，血管壁干细胞会从壁龛中被动员后释放出来，经过迁移与增殖等作用，逐渐修复损伤的血管，或者形成新生内膜。这些血管壁干细胞可分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞等。当血管发生较大损伤时，干细胞分化为内皮细胞参与血管的损伤修复;而当动脉粥样硬化病变时，这些内皮细胞在病变组织周围形成新生小血管，导致斑块破裂出血，斑块稳定性下降，易形成血栓。在血管内膜新生过程中，干细胞分化的平滑肌细胞不断迁移、增殖，可使血管内膜增厚，管腔狭窄。当干细胞分化为成骨细胞时，动脉粥样硬化斑块发生钙化，也会导致斑块的破裂。综上所述，血管壁干细胞虽然可促进内皮修复，但也同样会参与内膜的新生和降低斑块的稳定性，所以在临床上应用时，需要综合考虑各方面因素，权衡利弊，综合性治疗将成为未来研究的重点。
      胚胎干细胞与诱导的多功能干细胞在基础研究及临床应用上也得到长足的发展，在心血管疾病治疗方面，由干细胞分化而来的内皮细胞和平滑肌细胞可应用于新药筛选过程中，首先寻找出干细胞向两种细胞分化的平衡点，再研制出可以维持干细胞处于该平衡点的新药，最后应用于病人体内，达到理想的治疗效果，将不良影响降到最低点。此外，在细胞治疗中，这些细胞还是人工血管合成的优良材料，为移植血管治疗发展带来巨大的进步。