血管组织工程

      心血管疾病是全球最主要的死亡原因。世界卫生组织估计在2008年有1730万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的30%。仅血管疾病而言，美国就约有800万人患有外周血管疾病( peripheral artery disease )，每年超过63万人诊断为冠状动脉疾病。除了药物治疗外，通过外科手术在血管中植入支架( stent )或移植血管移植物(vasculargraft)是当前治疗血管疾病的重要手段。在过去20多年里，应用组织工程方法制造复合血管的研究取得了令人瞩目的成绩，作为血管移植物显示出巨大的潜力和前景，并可能为许多血管疾病治疗提供永久和有效的途径。
     血管组织工程是指利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来制备、重建和再生血管替代材料的科学。自从1986年Weinberg和Bell制成了首个组织工程血管移植物(tssue engineered vascular graft, TEVG )以来，研究人员对其进行了大量研究，以期最终研制出无免疫原性、抗血栓形成、组织和细胞相容性高、具有一定强度和生长性并能广泛应用于临床的组织 工程血管移植物， 以解决临床上治疗血管狭窄或闭塞导致的缺血性疾病，自体血管移植中血管来源有限的问题。
一、血管组织工程支架材料
      设计适合的组织工程血管支架是十分重要的，因为它能为血管组织的形成提供最初的空间模板和结构支持，并且可促进细胞的黏附、增殖和细胞外基质的形成。理想的组织工程血管对支架材料有如下要求:①良好的生物相容性;②表面化学特性和微结构易于细胞黏附、种植和发挥正常功能;③无免疫排斥性;④较好的生物可降解性;⑤足够的生物力学强度，可承受血液压力;⑥可渗出物及溶出物含量低;⑦降解速率可根据不同组织再生速度而调整，且降解后无毒;⑧来源广泛、性能稳定、经济适用、便于合成及消毒。
      研制开发理想的支架材料仍然是血管组织工程所面临的巨大挑战。当前研究的支架材料主要分为人工合成材料和天然生物材料，它们有各自的优点和不足。
(一)人工合成材料
1.不可降解高分子材料
      不可降解的材料被用于血管支架的最主要原因是它们的机械性较容易掌控。常用的人工血管支架材料有涤纶、ePTFE等，它们用于制作大口径血管移植物并在临床上广泛应用。当前涤纶支架常用于主动脉替换，ePTFE 用于股动脉胭动脉分流术。然而，应用这些材料制成的血管替代物移植体内后，血管的通畅率并不太好，如ePTFE用于股动脉胭动脉分流术，5年的通畅率仅为45%，而自体静脉移植物的通畅率可达 60%~ 80%。当人工合成不可降解的材料用于直径小于6mm的血管时，这些材料制成的血管移植物就出现许多问题，如不能形成理想的血管内膜，血管塑形效果差，吻合口处内膜增生严重，易形成血栓、狭窄、血管瘤及感染等。
2.可降解高分子材料
      目前，组织工程血管支架的许多研究工作集中在使用合成的生物可降解的高分子材料支架。使用生物可降解聚合物作为支架是一种制作有功能性血管的组织工程方法。在支架上植人细胞，移植体内后支架逐渐降解并被细胞及其分泌的细胞外基质所取代。
      （1）可降解高分子材料的类型   组织工程中应用的人工合成可降解高分子材料主要包括: 聚乳酸( poly-L-lactic acid, PLA )、聚羟基乙 酸( poly-glycolic acid, PGA)以及上述两种材 料的共聚物，如聚乳酸羟基乙酸[poly ( lactic-CO- glycolic acid), PLGA]、聚羟基丁酯( PHB )、聚碳酸酯和聚氨酯等。
      PGA是一种结构最简单的线性聚羟基脂肪酸酯，PGA的降解产物羟基乙酸是体内三羧酸循环的中间代谢产物，其吸收和代谢机制已经明确，所以具有可靠的生物安全性。但PGA在体内的降解速度过快，大约4周后支架就丧失强度，6个月就可被完全吸收。以PGA为主结构与其他聚合物共聚可控制其生物降解速率。
      （2）可降解高分子材料的优缺点   可降解高分子材料具有良好生物相容性，合成时对支架材料分子质量、表面形态、微结构、机械力学性能、降解速率等可预先设计和调控，通过控制条件，其生产重复性好，可以根据需要大批量生产，因此是组 织工程材料中研究最多、应用最广的支架材料。然而，可降解高分子聚合物材料也有其不足之处，最明显的是合成的生物材料可引发免疫反应，当它们被移植到体内时，常会引起机体的毒性及炎性反应、激活血小板和白细胞，致使血栓形成、VSMC增殖和内膜增生，最终导致组织工程血管移植失败。而且这些材料缺乏细胞外基质中的生物信号和功能基团，与种子细胞的黏附性较差。此外，研究还表明，在体内PGA的水解产物能够诱导VSMC产生去分化，这限制了PGA在血管组织工程中的应用。
(二)天然生物材料
      天然生物材料是指动、植物组织或人体内天然存在的高分子可降解材料，包括生物大分子材料，主要有胶原、纤维蛋白、蚕丝、壳聚糖、海藻酸盐和透明质酸等；脱细胞纤维组织结构材料，如脱细胞血管基质和脱细胞小肠黏膜下层基质等。生物材料本身含有供细胞生长、增殖和分化等所需的细胞因子及其他生物信号，有促进细胞黏附、调节细胞外液的化学组成及促进创伤愈合等作用。植入体内时，无或极低免疫反应，而且与受体的血管相容性好，其顺应性、通畅率都优于非生物材料血管。 
二、血管组织工程的细胞来源
      用于血管组织工程构建的最主要细胞类型，包括VSMC和EC，有各种不同的来源。自体血管壁分离的原代细胞最早作为细胞来源被应用于组织工程血管的构建。近年来，各种类型的成体干细胞，如骨髓来源的间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞等由于能够分化为各种血管细胞，已成为另一类很有前景的细胞来源。此外，多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonicstemcell, ESC)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC )等具有分化为所有体细胞的潜能包括各种血管细胞，因此已成为血管组织工程的新型细胞来源。各种细胞来源有其各自的优缺点，而且诱导分化技术将成为干细胞应用于组织工程血管构建的关键平台之一 。
（一）自体血管壁细胞
      结构完整、功能正常的血管对人体健康是十分重要的。它可以维持体内平衡，调节血流为全身各部分提供营养和氧气。正常的血管包括 3层结构:内膜( tunica intima )、 中膜( tunica media )和外膜( tunica adventitia )。内膜主要由单层EC组成排列于血管管腔内，与血液直接接触并提供一个连续性的选择性通透的表面。EC在调节血管的生理和病理过程中起着极其重要的作用。中膜主要是由VSMC组成，可调节血管的舒张和收缩，防止血管破裂。外膜主要是成纤维细胞。理想的组织工程血管移植物应具有与正常血管相类似的组织结构，而且在其内表面被覆内膜。由于EC具有强烈同种异体抗原性，因此，许多学者认为自体血管壁细胞包括EC、VSMC和成纤维细胞是血管组织工程的最佳种子细胞。
（二）多能干细胞
      多能干细胞能够无限自我更新并能分化成各种成体细胞，包括ESC、iPSC、胚胎肿瘤细胞、外胚层干细胞和胚胎生殖细胞等。
（三）成体干细胞
      成体干细胞是人体内各个组织中相对未分化的细胞。通过细胞表面标记物已经在许多组织器官包括骨髓、外周血、脐带血、心、血管、脾和脂肪组织等中发现存在成体干细胞，且也可分化成血管细胞。和胚胎干细胞一样，成体干细胞都能够解决成体细胞易老化的致命弱点，在组织工程中有广阔的应用前景。成体干细胞自体移植避免了免疫排斥、分离，而且使用成体干细胞也不存在伦理学问题。成体干细胞可能作为血管组织工程种子细胞的有骨髓间充质干细胞 ( bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC )和EPC等。
三、组织工程血管的构建
      组织工程血管的整体构建并非简单地将种子细胞移植到支架上，研究人员已经发展出各种不同的构建模式来完成，甚至不需要同时使用支架和种子细胞来完成组织工程血管的整体构建。构建的组织工程血管还需要在体内外特定的环境下 培养进一步成熟，并最终通过一系列的功能实验来评价构建的组织工程血管的性能。
（一）组织工程血管的构建模式
      目前，组织工程化血管的构建方法主要有以下几种：①在人工合成移植物(syntheticgraft)内种植EC；②以胶原和纤维蛋白为基础的血管移植物；③以生物可降解合成材料为支架构 建血管；④应用脱细胞组织支架( decellularized scaffold )构建血管；⑤无细胞支架技术，包括细胞自组装(cellself-assembly)血管和在体构建血管。
（二）组织工程血管体外培养 
1.组织工程血管体外培养方式
      虽然组织工程血管的构建出现许多新的模式，但传统的及常见的模式仍是在支架上种植种子细胞，通过体外培养成熟后再植入体内。组织工程血管体外培养的方式主要有两种：静态培养和动态培养。静态培养是指种子细胞和支架在静止状态、无特殊压力和环境变化的条件下所进行的培养；动态培养包括生物体内的培养和生物体外模拟生物体内环境即生物反应器( bioreactor )内的培养。天然血管暴露于压力、剪切力和脉动的血流等环境中，这些因素将刺激细胞按照合适的方向分化，进而产生胶原和弹性蛋白——血管壁胞外基质的主要组成成分，决定着血管壁的生物力学特性，而在静态环境中这些蛋白的生成是有限的，因此动态培养显著优于静态培养。
2.血管生物反应器
      血管组织工程生物反应器作为组织工程血管体外动态培养的重要方式，主要是根据人体血管所处的血流动力学环境(主要是剪切应力和拉伸应力)，在体外模拟血管搏动和血流对内皮的剪切作用，从而构建组织工程化血管。生物反应器的发展为组织工程的发展提供了载体，在生物反应器内进行血管三维构建和培养已成为目前血管 组织工程常用、有效的方式。 生物反应器相对于静态培养技术的优越性在于可以促进细胞长人支架，促进细胞外基质的产生、细胞的分化及组织的构建等。
3.生长因子对组织工程血管体外培养的作用
      生长因子在血管组织工程中可以调节细胞的表型。例如，PDGF可以促进VSMC增殖而使VSMC标志物α-SMA表达下调，TGFβ则抑制 细胞增殖但增加VSMC α-SMA表达。许多生长因子调节血管再生，如VEGF可促进血管的生长、分化、再生。用含有VEGF的葡聚糖水凝胶可促进hESC分化为血管细胞系。然而，应用单一因子刺激血管再生在临床上应用有一定的不足。血管的形成和稳定是多因素调控的过程，应用多种生长因子可能会更加有效。因此，研究人员期望研发一种药物释放体系能够同时释放多种生长因子。
（三）构建组织工程血管的功能评价
      对于应用不同模式或方法构建出来的组织工程血管是否存在优点和不足，需要通过一定的方式给予评价。就功能性而言主要包括以下几个方面：①生物学评价：通过测定弹性蛋白、胶原蛋白的合成速率以及材料降解速率来反映组织工程化血管的生物学功能。②组织学评价：通过免疫学染色来显示血管的三层结构、细胞成分及细胞外基质。③生物力学评价：生物力学评价的方法仍在探索之中，组织工程化血管的机械特性取决于平滑肌细胞及其产生的细胞外基质中胶原蛋白、弹性蛋白的含量。