外膜功能与调节

      血管外膜含有作为框架的ECM，还富含神经、血管和淋巴管道，这些成分的多样性使外膜成为血管壁最复杂的异质群体。外膜成纤维细胞通过产生BCM，形成一种支撑框架对组织起机械张力作用。同时，滋养血管通过其细小分支向血管输送氧气和各种营养成分;自主神经纤维通过释放神经递质使血 管保持定的扩 张性。然而，近年在脊椎动物的研究中发现，结缔组织是所有组织中的重要结构成分，其结构的异质性使结缔组织的功能得到新的认识。亦正因为此，人们开始重新认识外膜。
一、血管外膜的功能
(一)释放生物活性分子
      血管外膜成纤维细胞、脂肪细胞及ECM等均可以分泌多种生物活性物质，通过自分泌与旁分泌作用维持与调节血管的结构功能。外膜成纤维细胞在生理情况下分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质；在低氧等病理生理因素刺激下，分泌细胞因子、脂肪因子、炎症因子及增加ECM。血管外膜还可以分泌外 膜衍生的舒张因子( adventitia-derived relaxingfactor，ADRF)，受酪氨酸激酶及蛋白激酶调控。成纤维细胞产生的ECM主要成分是胶原纤 维，包括I、II 型胶原。
      此外，血管外周脂肪组织除了释放多种具有生物活性的脂肪因子及细胞因子，还分泌其他活性因子参与血管功能调节。我们采用血管外周脂肪组织条件培液刺激血管外眼成纤维细胞，发现后者迁移活性增强，成肌纤维细胞分化的特异标志a-SMA表达增高,提示条件培养液中含有促使细胞迁移及分化的因子。进步质谱分析鉴定发现血管外周脂防组织合成并释放大量的补体C3，有趣的是应用C3a受体抑制剂可显著抑制血管外周脂肪组织条件培养液诱导的成纤维细胞迁移和分化，提示脂肪组织分泌的补体C3具有调节外膜成纤维细胞功能的活性。
(二)维持血管张力与结构
      正常情况下，内皮细胞产生的大量NO使血管处于扩张状态，而外膜成纤维细胞则通过NADPH氧化酶产生一定量的活性(reactive oxygen species, ROS)，特别是超氧阴离子('O2)能够清除内皮衍生的NO，并降低其生物学活性。成纤维细胞释放的ROS还可以直接作用于邻近的平滑肌细胞增加其收缩力;超氧阴离子还可以直接激活细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signal-regulated protein kinase, ERK )导致细胞内钙增加；经超氧化物歧化酶产生的过氧化氢( H2O2)可以弥散人成纤维细胞或平滑肌细胞，引起细胞收缩、生长或迁移。此外，成纤维细胞合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成具有周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相黏合形成胶原纤维，以维系血管外膜疏松结缔组织的结构。总之，外膜成纤维细胞在一系列微环境的刺激下，既分泌ADRF使血管呈松弛状态，亦释放ROS通过信号系统产生大量介质，包括内 皮素1 ( endothelin 1, ET1 )、血小板源生长因 子( platelet -derived growth factor, PDGF )、表 皮生长因子( epidermal growth factor, EGF )、 成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor, FGF )、前列腺素H2 ( prostaglandin H2 , PGH2 )及ECM等，从而增加细胞收缩能力，保持血管的正常张力与结构。
(三)调节血管收缩与舒张
      以往观念认为PVAT对外源性分子起了屏障作用，因此对血管功能几乎不起作用。随着对外膜成纤维细胞的认识，人们发现血管外周脂肪组织释放的脂肪因子等对血管产生显著的旁分泌作用。PVAT释放的最重要物质是脂肪因子，即脂肪细胞起源的类似细胞因子效应的活性物质，如脂联素与瘦素发挥抗收缩或直接的血管扩张 作用。PVAT 对血管具有双向调节作用：①减弱对各种激动剂的血管收缩反应，如去氧肾上腺 素、5-羟色胺和血管紧张素II( angiotensin II， AngII )；②促进对神经刺激的收缩反应，尤其是肠系膜动脉PVAT。PVAT富含ROS，激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激 酶( mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase, MAPK/ERK )通路产生超氧化物和过氧化氢，前者促进血管对激动剂的收缩反应，后者促进血管对神经刺激的反应。
二、血管外膜功能调节
(一)自主神经系统调节
      血管外膜的交感神经在调节血压以维持各种生理反应的心血管动态平衡中发挥着重要的作用。交感神经末梢释放出的神经递质，如去甲肾 上腺素和神经肽Y ( neuropeptide Y， NPY )扩散到血管中膜，并作用于平滑肌受体引起血管收缩。然而，另一些神经释放的物质包括P物质、 乙酰胆碱和降钙素基因相关肽( calcitonin gene- related peptide, CGRP )引起血管舒张。自主神经通过调节中膜平滑肌收缩与舒张从而控制管腔大小，引起内向和外向的血管重塑过程。另有研究报道，NO可能由交感神经末梢直接释放，或者通过外膜中的神经末梢释放的神经递质激活内皮细胞释放。因此，这些神经纤维参与局部血管调节，通过轴突释放神经递质从而改变血管阻力和血流，而自主神经的调节异常被认为是引起高血压的原因之一。
      另一方面，在动脉粥样硬化的动脉中，外膜的肥大细胞与神经纤维直接接触。这些神经纤维表达P物质和CGRP,提示这些神经肽在增加血管通透性和招募炎性细胞从而打大血管损伤过程中发挥着重要的作用。
(二)信号转导系统调节
      当血管外膜感应物理、化学及机械等一系列因素的刺激后，可激活特异性的信号传导途径、协调病理生理反应.触发细胞内信号级联反应影响血管重塑时的细胞进程，从而导致血管功能素乱。从细胞增殖到生长遏制、衰老和死亡，不同效应取决于ROS的种类及剂量、作用时间和细胞类型。然而无论什么效应，它主要反映的是氧化侵装而激活的细胞内多种不同应激信号之 间的平衡，如MAPK ；激活与外膜损伤及重塑有关的受体和非受体依赖性酪氨酸微酶和转录因 子如核因子-kB (NF-kB )和转录因子活化蛋白1 ( atvator poctin 1，AP1)， 这些途径主要通过修饰转录因子活性，作用于基因表达模式来发挥对细胞表型及功能的效应。
      1.丝裂原活化蛋白激酶信号通路  丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路参与调控广泛的细胞过程，包括增殖、分化、应激适应和调亡。根据结构上的不同，MAPK分为三个亚族:ERK、c-JUN N-端激酶 (c-JU NN-eminal kinse，JNK)和P38激酶。ERK、JNK和P38亚族由独立的信号级联反应激活，涉及负责磷酸化MAPK的MAPK激酶( MAPK kinase， MAPKK/MEK )和磷酸化MAPRKK的MAPRKK激 酶( MAPKK kinase, MAPKKK)。 MAPK通过调节大量不同效应蛋白(特别是转录因子)的磷酸化作用，最终导致基因表达的改变。ERK途径通常与调控细胞增殖有关，而JNK和P38途径主要与应激有关。因此它们常同时被协调地 激活，JNK和P38常被归类为一组， 统称为应 激激活蛋白激酶( stress activated protein kinase, SAPK )。ROS作为第二信使强烈地激活MAPK，而MAPK受磷酸化级联反应调节，ROS通过调节上游的MAPK激酶、酪氨酸激酶和磷酸酶，抑制酪氨酸磷酸酶活性，增强MAPK活性，从而激活转录因子，调节其氧化还原状态，进而调节基因表达，从而诱导成纤维细胞增殖，增加促炎分子的表达，诱导脂质过氧化、单核细胞迁移、ECM蛋白沉着等血管损害过程。
      2.RhoA/ROKα  Rho是Ras单体GTP酶超家族的一员，有RhoA、RhoB、RhoC三种异构体。Rho 蛋白激酶( Rho-associated coiled-coil containing protein kinase, ROCK )属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是RhoA的下游靶效应分子，在细胞内以两种形式存在，ROKα (也称ROCK II )和p160ROCK(也称ROCK β 或ROCK I)。Rho蛋白可呈胞质游离型或与膜结合型，能够结合并水解鸟苷酸，使其在有活性的GTP结合状态与无活性的GDP结合状态之间循环。在细胞的信号转导通路中，Rho蛋白起到分子开关作用，Rho激酶调节细胞的多种生物学行为和功能，如收缩、黏附、迁移、地殖、凋亡、基因表达等。已证实Rho/ROCK 信号通路可与Smad蛋白( drosophila mothers against decapentaplegic protein)、 NFKB、JAK/STAT ( Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)、MAPK、mTOR(mammalian target of rapamycin )、整合素受体信号通路等之间形成复杂的网络来影响信号的转导。我们研究发现，RhoA/ROKα 信号通路参与调节血管损伤应答，在小鼠颈动脉损伤模型中，应用显性失活 ( dominant negative ) RhoA腺病毒经外膜途径给药，可阻断RhoA信号通路，显著抑制新生内膜的形成，降低细胞增殖，减少内膜/中膜的面积比。
      3.AP1和NF-kB   上述蛋白激酶的磷酸化可引起级联反应。将细胞信号由胞质传递至核内、活化转录因子激活相应的靶基因，调控 细胞的增生、分化和凋亡等。NF-KB 和AP1是目前研究得较为清楚的受氧化还原调节的两个转录因子，活性氧可以直接激活转录因子NF-KB和AP1，诱导促炎基因表达。多数氧化还原敏感的转录因子具有保守的半胱氨酸，由它构成的氧化还原巯基“开关”能够直接调节基因表达；其蛋白降解也具有氧化还原敏感性。
      转录因子AP1是由基因c-fos、c-jun编 码的蛋白产物，分别形成Fos家族( c-Fos、 FosB、Foral、 Fraz )蛋白和Jun家族( c-Jun、 JunB、JunD )蛋白，它们通过亮氨酸拉链结构 形成同源( Jun与Jun)或者异源( Jun与Fos )二聚体，构成转录因子AP1。AP1在细胞增殖 转录时调控细胞多种基因的表达。AP1 可直接 或通过转化生长因子β ( transforming growthfactorβ,TGFB)间接促进胶原基因的转录，且对α胶原基因也具有负向调控作用。近期研究证实血管紧张素I可以通过激活转录因子AP1促进成纤维细胞转化。研究发现通过转染API寡核苷酸，竞争性地抑制内源性转录因子AP1和核内基因启动子结合，抑制基因转录，能够有效地减少AngI诱导成纤维细胞的增殖和合成胶原，进一步证实了API在成纤维细胞病理性增殖和胶原堆积中发挥者重要的作用。NF-KB是由Rel蛋白家族的两位成员组成，最常见形式是由PS5和P65两种蛋白组成。在静息状态下NF-KB与其天然抑制因子IkB结合存在于胞质内，对靶基因不发挥调控作用。当细胞受到刺激后IkB被磷酸化。随之被泛索化蛋白小体降解，从而释放NF-KB进人胞核。NF-kB与靶基因启动子上的顺式作用元件结合，从而促使基因表达并放大炎症反应，刺激炎性细胞因子 的分泌。而NF-KB 是一种活跃的转录因子， 参与多种炎症介质和细胞因子基因的表达调控，故成为炎性疾病的关键因子之一。NF-KB在激活的成肌纤维细胞中表达增多，可进一步激活其下游基因IL6及细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule, ICAm )的表达。
(三)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[ NAD(P)H ]氧化酶
      血管外膜富含NAD(P)H氧化酶，通过调节ROS引起血管功能变化。NAD(P)H氧化酶的基本特征是以NADHNADPH为底物，将一个电子传递给氧分子形成*O2，O2作为超氧化物歧化酶的底物进一步被催化为H₂O₂，后者则被过氧化氢酶降俪为水分子和氧分子。'O2和H₂O₂是血管局部活性氧物质ROS的主要成分。生理状况下，血管NAD(P)H氧化酶本身构成即具有活性，它以一种缓慢持续的方式在细胞内产生'O2，作为细胞内的信号分子。这一基本水平的ROS，参与维持细胞的基本活动，包括血管张力、细胞衰老、细胞生长与信号。在不同的刺激作用下，外膜成纤维细胞NAD(P)H氧化酶活性增强并产生ROS，促进炎症因子表达，从而招募炎性细胞到血管外膜，随后这些炎性细胞通过其自身的NAD(P)H氧化酶产生更多ROS,从而放大ROS的作用：①作为信号分子调节外膜成纤维细胞增殖、迁移、分化和细胞外基质产生；②作为旁分泌分子调节邻近细胞引起血管收缩和血管重构。