蛋白水解酶和血管基质降解

      蛋白酶主要包括 MMP、半胱氦酸蛋白酶(主要指溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶）、丝氨酸蛋白酶（如组织型和尿激酶型纤溶酶原激活剂、组织蛋白酶G、肥大细胞食糜酶和类胰蛋白酶等）以及门冬氨酰蛋白酶（如组织蛋白酶E、D)。MMP 可能是所有这些蛋白酶中研究得最为透彻的成员。
一、基质金属蛋白酶
      MMP 是含锌的中性肽链内切酶。已经确定的至少 23 种不同的成员分别降解细胞外基质中不同的成分。它们的活性受到转录、酶原活化以区与 TIP 相互作用的调控。在对健康受试者年龄、性别、血压、心率、体重指数、吸烟、血糖、总胆固醇和血浆 C反应蛋白 ( C-reactive protein,CRP）进行校正后发现，血浆 MMP2 和 MMP9水平与颈动脉僵硬度和波反射(由颈股脉搏波传导速度和主动脉增强指数决定)呈负相关。
      不同的刺激决定了脉管系统中不同MMP 水平的表达。在正常血管壁可检测到基础水平的MMP2，但MMP9 只在损伤或炎症刺激后才有表达。不同的内源性 TIMP 与不同的 MNP 相五作用。MMP2 与TIMP2 作用，TIMP1 优先与MMP9 作用。MMP2 和MMP9 促进平滑肌细胞迁移和新生内膜形成，MMP9 与平滑肌细胞表面糖蛋白CD44 的相互作用对胶原排列、凝结起一定作用。MVP2 和 MMP9 参与急性冠状动脉综合征以及主动脉瘤的进展。在颈动脉结扎诱导的新生内膜模型，MMP2 和 MMP9 缺失可减少新生内膜形成。在体外，来源于 MMP2^-/-和 MMP9^-/-小鼠的平滑肌细胞明胶浸润减少。然而，只有 MMP9^-/-小鼠平滑肌细胞的胶原纤维排列遭破坏，胶原的凝结聚集和明胶黏附力减弱。因此，MMP 在血管壁的功能可能很复杂。我们将选择腹主动脉瘤和动脉粥样硬化两个例子来简单讨论 MMP 在这些血管疾病中的功能。
二、基质金属蛋白酶与腹主动脉瘤
      蛋白酶介导的细胞外基质重塑是腹主动脉瘤的一个重要发病机制。在初始阶段，胶原蛋白含量的增加不相称地高于弹性蛋白。大量研究已证明腹主动脉瘤主动脉中弹性蛋白酶的活性增加。弹性蛋白水解可能是主动脉机械性能损害的主要事件。随后，间质胶原纤维在承受机械应力方面起主要作用。腹主动脉瘤胶原的降解超过纤维状胶原合成的增加和结缔组织修复，导致抗拉强度减弱和快速的腹主动脉瘤扩张。
      在全部已知的与腹主动脉瘤进展有关的蛋白酶中，MMP 可能起着很重要的作用。与正常组织相比，MMP 在腹主动脉瘤过度表达，MMP与TIMP 的平衡向蛋白水解活性方向转变，腹主动脉瘤处发现有促 MMP 激活的分子增加，实验动物中弹性蛋白酶灌注促进腹主动脉瘤的进展，多西环素对 MMP 的抑制保护了主动脉壁的弹性蛋白。组织提取物 ELISA 检测显示，人腹主动脉瘤病变中 MMP8 和 MMP9 水平升高。主动脉样品的 Realtime-PCR 以及免疫染色检测到了人腹主动脉瘤中 MMP13 的表达。免疫染色显示在人动脉瘤样病变中 MMP1 和MMP3 表达增加，总胶原蛋白含量减少。其他基质金属蛋白酶，包括 MMP2、MMP12 和 MT1-MMP 都在腹主动脉瘤有表达。胶原酶基质金属蛋白酶包括 MMP1、MMP8 和MMP13，都具有降解间质I型胶原、II型胶原和III型胶原的活性，MMP1 和 MMP13主要降解II型胶原和III型胶原，MMP8 主要降解I型胶原。只有在这些初始降解后，胶原才可由其他基质金属蛋白酶降解。人腹主动脉瘤中这些 MMP 胶原酶的增加可以解释病变中胶原的减少。平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞都表达MMP1 和MMP13，多形核白细胞则表达 MMP8(也称为中性粒细胞胶原酶）。
      MMP 家族的几个成员已经在腹主动脉瘤的实验动物中被检测到。 MMP9 有弹性蛋白酶、胶原酶和明胶酶活性。正常主动脉组织中的 MMP9 微乎其微。腹主劲脉瘤病变中增加的MMP9 位于浸润在血管外膜和滋养管的巨噬细胞中。许多蛋白酶与 MMP9 的激活有关，包括尿激酶型纤溶酶原激活剂、组织型纤溶酶原激活剂、纤溶酶原激活抑制剂、 MMP2、MMP3 和MMP12。 在猪弹性蛋白酶主动脉灌注诱导的实验性腹主动脉瘤模型中，MMP9 的缺失保护了主动脉中膜的弹性蛋白，从而阻止了小鼠腹主动脉瘤的形成。腹主动脉瘤中升高的 MT1-MMP主要位于浸润的巨噬细胞。将MT1-MMP 敲除的小鼠骨髓移植到腹主动脉周边氯化钙损伤诱导的腹主动脉瘤小鼠中，小鼠未能产生腹主动脉瘤。MT1-MMP 敲除小鼠中腹主动脉瘤的减少可以通过给子野生型小鼠的巨噬细胞来逆转，表明巨噬细胞来源的 MT1-MMP 在弹性蛋白的降解中发择着主导作用。在腹主动脉外周氯化钙损伤诱导的小鼠腹主动脉瘤模型中， MMP2、MMP9和 MMP12 缺失可以保护小鼠免于动脉粥样硬化中膜破坏以及随后的腹主动脉瘤形成。与此相反，TIMPI^-/-小鼠的腹主动脉瘤则发生扩张。大鼠模型中过表达 TIMP1 可防止主动脉瘤的恶变和破裂。
      腹主动脉瘤中 MMP 最具特色的活性是它们对弹性蛋白和胶原蛋白的作用。除了降解这些细胞外基质蛋白，MMP 还参与细胞外基质的排列组合、平滑肌细胞迁移和新生血管形成。离体实验中平滑肌细胞在胶原蛋白凝胶中的凝集与排列需要MMP9，但不是MMP2。 MMP2 或 MMP9缺失表现为体外平滑肌细胞明胶浸润能力和体内新生内膜的形成受损。用bFGF 和 TNFα处理后，人包皮微血管内皮细胞能在含10%纤维蛋白的胶原蛋白凝胶中形成管状结构。在这个实验模型中，用MMP 广谱抑制剂 BB94 或腺病毒转染人TIMP3 和TIMP1 抑制基质金属蛋白酶都可以抑制血管新生。
三、基质金属蛋白酶与动脉粥样硬化
      和腹主动脉瘤病变一样，人动脉粥样硬化病变部位已经检测到许多基质金属蛋白酶，包括 MMPI、 MMP2、MMP3、MMP9 以及它们的内源性抑制剂TIMP1。血清 MMP3、MMP9 与TIP1 的水平与颈动脉病变呈显著正相关。冠心病患者的血浆胶原酶 MP8 水平显著高于非冠心病患者(3.5ng/ml vs. 3.0ng/ml, P<0.001)，并且随狭窄血管的数目增加而逐步增加。人动脉粥样硬化病变部位的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞是 MMP1、MMP8 和 MMP13 三种 MMP胶原酶的主要来源。
      在小鼠饮食诱导的动脉粥样硬化模型中，MMP9^-/-ApoE^-/-小鼠（而非 MMP12^-/-ApoE^-/- 小鼠）的动脉粥样硬化病变面积、病变部位巨噬细胞的浸润以及胶原沉积都显著减轻。人清道夫受体A增强子/启动子能够引导转基因在动脉粥样硬化病变部位的巨噬细胞系和泡沫细胞中特异性表达，在它的调控下转基因表达人 MMP12 CDNA，能导致免的高脂血症加重和动脉粥样硬化增加。与对照组相比，MP12 转基因的兔动脉粥样硬化病变部位巨噬细胞浸润和弹性蛋自层碎裂增加，MMP3 的表达升高。然而，在 ApoE^-/- 小鼠或 TIMPI^-/-ApoE^-/- 小鼠用相同的增强子/启动子转基因表达人 MMP9 的前体，则对动脉粥样硬化病变的增长没有影响。令人奇怪的是，MMP9基因的 TIMPI^-/-ApoE^-/- 小鼠与非转基因组相比，动脉粥样硬化病变部位胶原含量显著增多，从这些转基因小鼠来源的巨噬细胞也释放更多的TGFβ1。在旁路静脉移植术模型中，MMP9^-/-小鼠相此，外弹性蛋白层的周长和移植物的厚度并无显著差异。与此相反，MMP9^-/-小鼠移植物的 MMP2 和胶原蛋白水平却升高了。因此，在动脉粥样硬化中，MMP 的活性可能依赖于实验模型，而且每个MMP 可能针对不同的细胞外基质蛋白或具有其细胞特异的活性。
      体外血管平滑肌细胞浸润I型胶原/ III胶原3-D基质需要 MT1-MMP 活性。如果把小鼠主动脉中膜植人这个3-D基质，只有MMP泛抑制剂 BB94 和TIMP2 可以抑制平滑肌细胞浸润，而TIMPI 或其他蛋白酶抑制剂(E64d、胃蛋白酶抑制剂、抑肽酶）则没有这一效应。MT1-MMP缺陷小鼠的中膜移植物可使平滑肌细胞浸润減少，而纤溶酶原、MMP2、MMP9缺陷小鼠的中膜移植物则无此效应。在左颈总动脉结扎诱导的新生内膜模型中，MT1-MMP缺陷小鼠与对照小鼠相比，新生内膜形成显著减少。原代大鼠主动脉平滑肌细胞中 TNFα 和PDGF-BB 会增加含血小板反应蛋白基序的解聚金属蛋白酶7的表达。ADAMTS7 表达导致平滑肌细胞迁移和浸润增加。大鼠球囊损伤血管后血管腔内输人ADAMTS7 可使内膜增厚6倍，血管周围给它的 SiRNA 使内膜增厚减少了50%。因此，MT1-MMP 和 ADAMTS7 在动脉粥样硬化病变过程中对胶原蛋白的降解起着重要的作用。
      非选择性基质金属蛋白酶抑制剂在体外实验中有抗迁移和抗增殖作用，并在一些在体动物模型中表现出抗再狄窄作用。许多MMP 抑制剂也抑制 MMP 的表达。MMP抑制剂 GM6001 阻断了免模型中的支架内增生。TIMP1 过表达减少了大鼠颈动脉球装损伤导致的新生内膜增生和免再狹窄模型中的内膜增厚。腺病毒介导的人TIMP1 基因转人抑制了人大隐静脉的平滑肌细胞迁移和新生内膜形成。目前已经有很多能间接影响 MMP 表达或直接抑制MMP 活性的化合物进人人体临床试验中来抑制腹主动脉瘤的生长。
      曲匹地尔( Trapidil）是一种抗血小板药物和CD40-CD40 配体通路抑制剂。他汀类药物是常见的降脂药物。曲匹地尔和他汀类药物在人主动脉器官培养或腹主动脉瘤实验模型中都可以抑制MMP 表达。曲匹地尔能减少人经皮冠状动脉介入治疗 (percutancous coronary intervention,PCI）后的再狹窄。他汀类药物已进行了一些腹主动脉瘤人体试验，多数都表明它能有效抑制MMP 的表达或活性，但还是有一些试验发现他汀类药物没有抑制 MMP 的活性。在人体试验中测试的最佳 MMP 抑制剂可能是多西环素，它是一种可以非特异性抑制 MMP 和影响 MMP 表达的四环素类抗生素。在动物实验中能成功抑制腹主动脉瘤使多西环素得以进行人体临床试验。虽然一些样本数量很少的、随机、安慰剂对照试验和双盲、随机、安慰剂对照研究显示它能成功抑制MIMP 的活性，但在其他几个双盲、随机研究和前瞻性（二期）多中心研究中并不能有效抑制MMP 活性或血管重塑。在一个单中心非随机观察性研究的 1019例患者中，PCI术后的临床不良事件，包括心肌梗死、再次PCI、冠状动脉旁路移植术、6个月后的总死亡率及再狹窄率并没有受到多西环素治疗的影响。只有一个非糖尿病男性吸烟患者亚组比未治疗组的再狭窄率降低。因此，MMP 在血管重塑中的作用和临床意义还需要进一步的评估。
四、腹主动脉瘤和动脉粥样硬化中的半胱氨酸组织蛋白酶
      半胱氦酸组织蛋白酶包含 12个位于不同染色体上的成员。有些在人体所有组织或细胞中有基础性高表达[如组织蛋白酶B（cathepsin B, CatB)了 或低表达（如CatL），但也有一些在特定的细胞类型中才表达。例如，CatS 表达在抗原呈递细胞而 CatK则在破骨细胞中表达。然而在动脉粥样硬化、腹主动脉瘤、静脉曲张等炎性条件下，大多数这些组织蛋白酶的表达均有不同程度升高。这些与脉管系统中细胞外基质重塑相关的蛋白酶最重要的特性是其对胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及其他未检测到的细胞外基质蛋白具有蛋白水解活性。在动脉粥样硬化和腹主动脉瘤实验模型中，表达增加的组织蛋白酶主要位于弹性蛋白层碎裂和胶原蛋白缺失的部位。遗传缺陷或药物抑制 CatS 、K和L已被证实在动脉粥样硬化和腹主动脉瘤中有保护作用，表现为保护主动脉组织弹性蛋白和胶原蛋白。相比之下，半胱氦酸蛋白酶内源性抑制剂胱抑素C在人动脉粥样硬化、腹主动脉瘤和静脉曲张中表达则不足。
      颈动脉内膜切除术得到人体颈动脉斑块，其组织提取物的 Westemn blot 和比色法检测发现人体动脉粥样硬化病变部位存在胱抑素C、胶原蛋白和弹性蛋白。Pearson 相关分析（参数数据）和 Spearman 相关分析（非参数数据）的分析证明，斑块胱抑素 C的含量与总弹性蛋白（r=0.58,P=0.001 ） 总胶原蛋白（r=0.50，P=0.004）交联弹性蛋白（r=0.42，P=0.022）交联胶原蛋白（r=0.52，P=0.003）都呈正相关，辅证了半胱氨酸组织蛋白酶参与人动脉粥样硬化弹性蛋白与胶原蛋白降解的这一假设。虽然还没有其他相类似的研究，但是在人腹主动脉瘤病变和静脉曲张中可能也存在类似的相关性。